感覺態(tài)細(xì)胞的制備：
注①：有化轉(zhuǎn)和電轉(zhuǎn)兩種。
注②：制備具體步驟因人而異。
將處于對數(shù)生長期的大腸桿菌（細(xì)胞的感受態(tài)一般出現(xiàn)在對數(shù)生長期，新鮮幼嫩的細(xì)胞是制備感覺態(tài)細(xì)胞和進(jìn)行成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。對數(shù)生長前期的細(xì)菌可通過測定培養(yǎng)液的OD600控制，所以要嚴(yán)密監(jiān)測細(xì)菌的OD值）置于經(jīng)低溫預(yù)處理的低滲CaCl2溶液（CaCl2和水需是較高純度的）中，在低滲CaCl2溶液中，細(xì)胞會膨脹，同時Ca2+還會使磷脂雙分子層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開來，離開所在區(qū)域，細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化，極易與外源DNA相粘附并在細(xì)胞表面形成抗脫氧核糖核酸酶的羥基－磷酸鈣復(fù)合物。（整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，所用器皿高壓滅菌處理）添加其它的二價金屬離子、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理，提高轉(zhuǎn)化率。
感覺態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化注意事項(xiàng)：
連接反應(yīng)產(chǎn)物在轉(zhuǎn)化之前在70ºC熱滅活15min，連接產(chǎn)物在熱滅活后無需純化可直接使用；
DNA樣本必須是溶解于ddH2O或TEbuffer的純化樣本。電轉(zhuǎn)化樣本中如果存在鹽離子會導(dǎo)致電轉(zhuǎn)過程中的高壓電弧，從而引起細(xì)胞和DNA的損失；
微量離心管和電轉(zhuǎn)杯在使用前必須冰浴；
在使用之前必須在冰上解凍；
為了得到高效的轉(zhuǎn)化效率，請使用試劑盒中的重懸電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞，如果使用TB或其它培養(yǎng)基會降低感受態(tài)的轉(zhuǎn)化效率；
電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞可以在LB或其它常規(guī)培養(yǎng)基上涂板。
滬ICP備14030958號-14 管理登陸 技術(shù)支持：化工儀器網(wǎng) GoogleSitemap