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    單細胞水平的轉錄

    點擊次數(shù):1190次  更新時間:2015-06-01

    原位雜交(ISH)這種顯微鏡方法解決了這兩個問題。它利用標記的核酸探針來確定組織及細胞中DNA或RNA的空間位置和豐度。這種方法有兩種形式,熒光(FISH)和顯色(CISH)。之前,F(xiàn)ISH和CISH一直是定性的:要么陽性,要么陰性。隨著技術的發(fā)展,定量版本也被開發(fā)出來。

    單分子熒光原位雜交(smFISH)是一種新的基因表達分析方法,能報告轉錄本豐度和空間定位。但到目前為止,smFISH還不能實現(xiàn)基因組范圍的分析。如今,瑞士蘇黎世大學的研究人員報告了一種策略,讓smFISH也插上高通量的翅膀。1

    蘇黎世大學分子生命科學研究所的Lucas Pelkmans領導了這項研究。他解釋道,傳統(tǒng)的smFISH有兩個主要缺點,阻礙了它的高通量應用。首先,它產(chǎn)生相對較弱的信號,信噪比不太高。其次,它不能擴展,因為它需要高的放大倍數(shù),長的成像時間,并且每個轉錄本的條件需要優(yōu)化。

    傳統(tǒng)的smFISH利用一系列短的寡核苷酸來檢測轉錄本,每個寡核苷酸上標記有一個熒光基團。這樣,mRNA上就有足夠濃度的熒光分子,產(chǎn)生可見的光點,但通常只有在60x或100x放大倍數(shù)下,使用油浸、大數(shù)值孔徑的透鏡才行。

    Pelkmans及其團隊以支鏈DNA(branched DNA)為基礎開發(fā)了他們的方法。在這一策略中,15對寡核苷酸探針靶定一個特定的mRNA。這些探針將作為一級preamplifier探針的著陸墊,又為一些二級的amplifier探針提供了結合位點,zui后是一組三級的標記探針。

    Pelkmans解釋道,這就像在轉錄本上種下了15顆雜交探針的樹。這種方法產(chǎn)生了放大的信號,亮度增加100倍,信噪比也提高3倍,而成像時間比傳統(tǒng)方法大大縮短。

    憑借這種強烈的信號,研究小組將實驗過程自動化。他們建立了928個人類基因的支鏈DNA庫,并用培養(yǎng)的HeLa

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    霍華德?休斯醫(yī)學研究所的項目科學家Timothee Lionnet認為這項研究是“自動化的力作"。他談道:“他們將FISH技術帶到了多重PCR或RNA-Seq技術所達到的通量。"

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