在自然條件下,很多質粒都可通過青海發(fā)光桿菌接合作用轉移到新的宿主內(nèi),但在人工構建的質粒載體中,一般缺乏此種轉移所必需的mob基因,因此不能自行完成從一個細胞到另一個細胞的接合轉移。如需將質粒載體轉移進受體細菌，需誘導受體細菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA。
轉化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領域的基本實驗技術。
轉化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子進入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細胞經(jīng)過一些特殊方法(如電擊法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化學試劑法)的處理后,細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變,成為能允許外源DNA分子進入的感受態(tài)細胞(Compenent cells)。進入受體細胞的DNA分子通過復制,表達實現(xiàn)遺傳信息的轉移,使受體細胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉化后的細胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉化子(Transformant,即帶有異源DNA分子的受體細胞)。目前常用的感受態(tài)細胞制備方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制備的感受態(tài)細胞轉化效率較高,但CaCl2 法簡便易行,且其轉化效率*可以滿足一般實驗的要求,制備出的感受態(tài)細胞暫時不用時,可加入占總體積15%的無菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法為使用更廣泛。
為了提高轉化效率, 實驗中要考慮以下幾個重要因素：
1. 細胞生長狀態(tài)和密度: 不要用經(jīng)過多次轉接或儲于4℃的培養(yǎng)菌，從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。細胞生長密度以剛進入對數(shù)生長期時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600 來控制。DH5α菌株的OD600 為0.5時,細胞密度在5×107 個/ml左右(不同的菌株情況有所不同),這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉化效率。
2. 質粒的質量和濃度: 用于轉化的質粒dna應主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時,轉化效率就會降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受態(tài)細胞達到飽和。一般情況下,DNA溶液的體積不應超過感受態(tài)細胞體積的5%。
3. 試劑的質量: 所用的試劑,如CaCl2 等均需是zui高純度的(GR.或AR.),并用超純水配制,分裝保存于干燥的冷暗處。
4. 防止雜菌和雜DNA的污染：整個操作過程均應在無菌條件下進行, 所用器皿, 如離心管, tip頭等是新的,并經(jīng)高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、dna酶或雜DNA所污染, 否則均會影響轉化效率或雜DNA的轉入, 為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。
本實驗以E.coli DH菌株為受體細胞,并用CaCl2處理,使其處于感受態(tài),然后與pBS質粒共保溫,實現(xiàn)轉化。由于pBS質粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr )，可通過Amp抗性來篩選轉化子。如受體細胞沒有轉入pBS，則在含Amp的培養(yǎng)基上不能生長。能在Amp培養(yǎng)基上生長的受體細胞(轉化子)肯定已導入了pBS。轉化子擴增后，可將轉化的質粒提取出，進行電泳、青海發(fā)光桿菌、酶切等進一步鑒定。
本實驗以E.coli DH菌株為受體細胞,并用CaCl2處理,使其處于感受態(tài),然后與pBS質粒共保溫,實現(xiàn)轉化。由于pBS質粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr )，可通過Amp抗性來篩選轉化子。如受體細胞沒有轉入pBS，則在含Amp的培養(yǎng)基上不能生長。能在Amp培養(yǎng)基上生長的受體細胞(轉化子)肯定已導入了pBS。轉化子擴增后，可將轉化的質粒提取出，進行電泳、酶切等進一步鑒定。
第二節(jié) 材料、設備及試劑
一. 材料
E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ;pBS質粒DNA: 購買或實驗室自制，eppendorf管。
二. 設備
恒溫搖床,電熱恒溫培養(yǎng)箱,臺式高速離心機,無菌工作臺,低溫冰箱, 恒溫水浴鍋, 制冰機, 分光光度計,微量移液槍。
三. 試劑
1.LB固體和液體培養(yǎng)基：配方見*章。
2.Amp母液：配方見*章。
3.含Amp的LB固體培養(yǎng)基:將配好的LB固體培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至60℃左右,加入Amp儲存液,使終濃度為50ug/ml,搖勻后鋪板。
4.麥康凱培養(yǎng)基(Maconkey Agar):取52g麥康凱瓊脂,加蒸餾水1000ml,微火煮沸至*溶解,高壓滅菌，待冷至60℃左右加入Amp儲存液使終濃度為50ug/ml,然后搖勻后涂板。
5.0.05mol/L CaCl2溶液:稱取0.28g CaCl2(無水,分析純),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高壓滅菌。
6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 稱取0.28g CaCl2(無水,分析純),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高壓滅菌。
第三節(jié) 操作步驟
一、 受體菌的培養(yǎng)
從LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α單菌落,接種于3-5ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃下振蕩培養(yǎng)12小時左右,直至對數(shù)生長后期。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)2-3小時至OD600 =0.5左右。
二、 感受態(tài)細胞的制備 ( CaCl2 法)
1、將培養(yǎng)液轉入離心管中,冰上放置10分鐘,然后于4℃下3000g離心10分鐘。
2、 棄去上清,用預冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml輕輕懸浮細胞,冰上放置15-30分鐘后,4℃下3000g離心10分鐘。
3、棄去上清,加入4ml預冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,輕輕懸浮細胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態(tài)細胞懸液。
4、 感受態(tài)細胞分裝成200μl的小份,貯存于-70℃可保存半年。
三、 轉化
1、從-70℃冰箱中取200μl感受態(tài)細胞懸液,室溫下使其解凍,解凍后立即置冰上。
2、 加入pBS質粒DNA溶液(含量不超過50ng,體積不超過10μl),輕輕搖勻,冰上放置30分鐘后。
3、42℃水浴中熱擊90秒或37℃水浴5分鐘,熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘。
4、向管中加入1ml LB液體培養(yǎng)基(不含Amp),混勻后37℃振蕩培養(yǎng)1小時,使細菌恢復正常生長狀態(tài),并表達質粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr )。
5、將上述菌液搖勻后取100μl 涂布于含Amp的篩選平板上,正面向上放置半小時,待菌液*被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿,37℃培養(yǎng)16-24小時。
同時做兩個對照:
對照組1: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應沒有菌落出現(xiàn)。
對照組2: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,但涂板時只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應產(chǎn)生大量菌落。
四、 計算轉化率
統(tǒng)計每個培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)。
轉化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉化子，根據(jù)此皿中的菌落數(shù)可計算出轉化子總數(shù)和轉化頻率，公式如下：
轉化子總數(shù)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×轉化反應原液總體積/涂板菌液體積
轉化頻率(轉化子數(shù)/每mg質粒DNA)=轉化子總數(shù)/質粒DNA加入量(mg)
感受態(tài)細胞總數(shù)=對照組2菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×菌液總體積/涂板菌液體積
感受態(tài)細胞轉化效率=轉化子總數(shù)/感受態(tài)細胞總數(shù)
[注意] 本實驗方法也適用于其它E.coli受體菌株的不同的質粒DNA的轉化。但它們的轉化效率并不一定一樣。有的轉化效率高，需將轉化液進行多梯度稀釋涂板才能得到單菌落平板,而有的轉化效率低,涂板時必須將青海發(fā)光桿菌液濃縮(如離心),才能較準確的計算轉化率。